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Descoberta de novos ativadores de troponina cardíaca usando polarização de fluorescência

Jul 11, 2023Jul 11, 2023

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 5216 (2023) Citar este artigo

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A grande procura não satisfeita de novas terapêuticas para a insuficiência cardíaca é amplamente reconhecida. Nas últimas décadas, os próprios miofilamentos contrácteis emergiram como um alvo atraente para o desenvolvimento de novas terapêuticas para a insuficiência cardíaca sistólica e diastólica. No entanto, o uso clínico de medicamentos direcionados aos miofilamentos tem sido limitado, e o progresso adicional tem sido dificultado pela compreensão incompleta da função dos miofilamentos no nível molecular e pelas tecnologias de triagem para pequenas moléculas que reproduzem com precisão essa função in vitro. Neste estudo, projetamos, validamos e caracterizamos novas plataformas de triagem de alto rendimento para efetores de pequenas moléculas visando as interações entre as subunidades da troponina C e da troponina I do complexo da troponina cardíaca. Ensaios baseados em polarização de fluorescência foram usados ​​para rastrear bibliotecas de compostos disponíveis comercialmente, e os resultados foram validados usando telas secundárias e ensaios ortogonais. As interações composto-troponina foram caracterizadas usando calorimetria de titulação isotérmica e espectroscopia de RMN. Identificamos o NS5806 como um novo sensibilizador de cálcio que estabiliza a troponina ativa. Em boa concordância, o NS5806 aumentou muito a sensibilidade ao cálcio e a força isométrica máxima do miocárdio de doador humano desmembrado. Nossos resultados sugerem que as plataformas de triagem dirigidas por proteínas sarcoméricas são adequadas para o desenvolvimento de compostos que modulam a função do miofilamento cardíaco.

A insuficiência cardíaca e as doenças cardíacas continuam a ser as causas predominantes de morte em todo o mundo e constituem um fardo significativo tanto para os sistemas de saúde como para as economias globais1,2. As terapias atuais para insuficiência cardíaca visam principalmente o alívio sintomático através da modulação neuro-humoral, mas geralmente não tratam as etiologias subjacentes da insuficiência cardíaca e podem causar efeitos colaterais indesejados3. Por exemplo, embora os inotrópicos comumente usados, como a dobutamina, aumentem o débito cardíaco, o tratamento geralmente está associado a efeitos colaterais graves, como arritmias e hipotensão4,5. Consequentemente, existe uma procura largamente não satisfeita de novas terapias farmacológicas para doenças cardíacas e insuficiência cardíaca.

Tornou-se cada vez mais evidente que as proteínas dos miofilamentos cardíacos são importantes reguladores da função do músculo cardíaco durante estados de saúde e de doença. Isto é destacado pelo fato de que mutações nos genes que codificam o motor molecular β-miosina cardíaca, a isoforma cardíaca da proteína C de ligação à miosina, as subunidades da troponina cardíaca e a tropomiosina são encontradas na maioria dos pacientes que sofrem de cardiomiopatia hipertrófica hereditária. CMH)6. Além disso, modificações pós-traducionais dessas proteínas sarcoméricas são importantes reguladores da função sistólica e diastólica7,8, e a hipofosforilação de proteínas tem sido frequentemente associada à disfunção do músculo cardíaco e à insuficiência cardíaca em pacientes humanos e em modelos animais9,10.

A contração do miofilamento cardíaco é iniciada pela ativação dependente de Ca2+ dos filamentos finos contendo actina. A ligação do cálcio ao complexo da troponina no início da sístole leva a um rearranjo estrutural da tropomiosina na superfície do filamento fino que expõe os locais de ligação da miosina na actina (Fig. 1a). Posteriormente, as cabeças de miosina dos filamentos grossos vizinhos ligam-se fortemente à actina e passam pelo curso de trabalho acoplado à liberação de produtos de hidrólise de ATP. O movimento de trabalho puxa os filamentos finos em direção ao centro do sarcômero, levando ao encurtamento muscular e à geração de força. Por outro lado, a liberação de cálcio da troponina desencadeia a desativação do filamento fino, seguida pela dissociação das cabeças de miosina da actina e pelo início do relaxamento mecânico11.

Triagens de alto rendimento para moduladores de troponina cardíaca. (a) Ilustração esquemática da via de ativação do filamento fino dependente de cálcio. No estado OFF do filamento fino (esquerda), os locais de ligação da miosina na actina (cinza claro) são bloqueados pela tropomiosina (Tm; cinza escuro). A ligação do Ca2+ à troponina C (cTnC; vermelho) permite a interação do peptídeo switch (SP; azul) com o lóbulo N regulador do cTnC (NcTnC; rosa). A remoção do domínio C-terminal da cTnI (CTD) permite que a Tm se mova azimutalmente ao redor do filamento fino, expondo os locais de ligação da miosina na actina. O cTnC do lóbulo C (CCTnC; vermelho) está constitutivamente ligado a cátions divalentes e à região de ancoragem do cTnI (roxo). (b) Estrutura atômica do complexo central da troponina cardíaca humana (PDB 1J1D). Os lóbulos N e C do cTnC são mostrados na representação da superfície em vermelho e rosa, respectivamente. A troponina I cardíaca (cTnI) e a troponina T (cTnT) são mostradas em roxo e laranja, respectivamente. A região de troca do cTnI é mostrada em azul. As interações moleculares entre cTnC e cTnI são destacadas por ovais tracejados amarelos. (c) Representação em desenho animado do HTS baseado em polarização de fluorescência (FP) desenvolvido que tem como alvo as interações cTnC-cTnI. Superior: tela baseada em FP visando a interação entre NcTnC e a região de troca de cTnI. Parte inferior: Tela baseada em FP visando a interação entre CcTnC e a região de ancoragem de cTnI. (d) HTS de três bibliotecas de compostos comercialmente disponíveis visando a interação entre cTnC e peptídeo switch (parte superior) ou a região de ancoragem de cTnI (parte inferior). Os acertos foram definidos por compostos que alteram o FP mais de cinco vezes o desvio padrão (5xSD) do valor médio (indicado por linhas vermelhas).

 3000 compounds in 384-well format (Fig. 1d). Negative and positive control wells were included in each plate and gave consistent Z’-factors of about 0.8 for each screening plate. Each compound was tested at a concentration of 50 μmol/L and 10 μmol/L for the cTnISP and cTnIAR screen, respectively. Hits were defined as compounds that changed the average FP value more than five-times the standard deviation (SD) (Fig. 1d, red lines). Moreover, compounds that either increased or decreased the total fluorescence intensity (FI) more than five-times the SD were removed from further analysis, indicating either compound aggregation or unspecific interactions with the fluorophore or protein complex./p> 10 μmol/L), potentially indicating assay interference. However, total fluorescence intensity of the assay mixture was not affected by either Claramine of Furamidine at concentrations of up to 100 μmol/L, suggesting that the sudden increase in FP is not caused by compound aggregation (Supplementary Fig. S2). This is further supported by high solubility of both compounds in aqueous solutions (> 25 mmol/L). We tested for the functional effects of the remaining four hit compounds by measuring the ATPase activity of bovine cardiac myofibrils at sub-maximal activation, corresponding to about 70% of the maximal ATPase activity (Fig. 2d). Both Icaritin and KT203 showed no effect on myofibrillar ATPase activity in a concentration range of up to 100 μmol/L and were excluded from further analysis. In contrast, Claramine and Furamidine decreased myofibrilar ATPase activity by about 40–50%./p> 100,000 compounds)./p> 300 μmol/L) but shows low micromolar affinity to a Ca2+-saturated cChimera. However, the functional effects of NS5806 on demembranted cardiac muscle fibres (i.e. increase in maximal force production) are different to those reported for the troponin activator RPI-19443, suggesting that both molecules stabilize activated troponin via distinct mechanisms. In contrast, NS5806 has similar functional properties to TA118, a cardiac troponin agonist currently undergoing Phase I clinical trials, albeit with lower potency. Although the origin of the increased maximal isometric force production by NS5806 (and TA1) is currently unknown, it is likely that even at full Ca2+-activation (pCa 4.5) not all thin filament regulatory units in demembranated cardiac muscle fibres are in the fully ON state and that addition of the troponin modulators completely activate the thin filaments. Alternatively, the increased force production might be related to off-target effects of these compounds./p> 95% by SDS-PAGE and electron spray ionization mass spectrometry (ESI–MS). The N-terminally 6-carboxy-fluoresceine (FAM) labelled A162H-mutated switch region peptide of human cardiac troponin I (sequence: TLRRVRISADAMMQALLGARHKESLDLR) and the N-terminally FAM-labelled anchoring region peptide of human cardiac troponin I (FAM-cTnIAR; sequence: SKISASRKLQLKTLLLQIAKQELERE) were purchased from Fisher Scientific (> 99% purity, TFA removed)./p> 95%. The purified protein was buffer exchanged using a PD10 desalting column and concentrated using a Vivaspin 20 concentrator with 5 kDa cutoff. All measurements were carried out in NMR buffer (composition in mmol/L: 20 HEPES pH 7.2, 100 NaCl, 5 CaCl2, 2 DTT, 0.02% (w/v) NaN3) with 10% (v/v) D2O in a total volume of 350 μL using a Shigemi tube./p> 80%) was confirmed by HPLC and ESI–MS. Labelled cTnC was gel-filtered into the interaction buffer. Titration experiments were performed with a fixed concentration of 100 nmol/L of Alexa647-labelled cTnC in premium capillaries at a constant temperature of 25 °C./p>

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